第一次使用紫外交联仪时，最容易出现的问题并不是“不会按Start键”，而是前面的实验条件没有确认清楚。

例如：

• 应该使用254nm、302nm还是365nm？

• 应该设置mJ/cm²还是直接设置时间？

• 膜需要干燥还是保持湿润？

• 培养皿盖到底要不要打开？

• 样品应该放在曝光室什么位置？

• 实验结束以后需要继续烘烤还是直接进入下一步？

这些问题如果没有提前确认，即使设备运行完全正常，也可能得到错误或者重复性很差的实验结果。

因此，紫外交联仪真正规范的使用顺序应该是：

明确实验目的 → 确认波长 → 准备样品 → 确认剂量或时间 → 放置样品 → 启动照射 → 结束处理 → 保存实验记录。

一、第一步不是开机，而是先确认自己究竟要做什么实验

紫外交联仪可以覆盖多种紫外实验，但不同实验并不能直接共用一个程序。

常见情况包括：

• Southern Blot、Northern Blot、Dot Blot等核酸膜固定；

• 经典CLIP等蛋白质-RNA直接紫外交联；

• PAR-CLIP等光反应核苷体系；

• UVB诱导DNA损伤或DNA修复研究；

• 部分紫外去污染实验；

• 其他已经明确规定波长和剂量的光化学实验。

这些实验的波长、样品形式、目标剂量以及后续处理完全可能不同。

所以不要建立一个所谓“紫外交联仪默认程序”，然后所有项目都直接调用。

二、第二步：根据实验方法确认254nm、302nm还是365nm

生命科学紫外交联实验中，经常接触到三种波长：

• 254nm UVC：常见于核酸膜固定和经典CLIP等实验；

• 302nm UVB：常见于UVB诱导DNA损伤、DNA修复和紫外应激研究；

• 365nm UVA：常见于PAR-CLIP、psoralen及其他UVA光反应体系。

图1：UVA、UVB和UVC属于不同紫外波段。紫外交联操作首先应该根据具体实验方法确定目标波长。

不能简单理解成：

254nm做DNA，365nm做蛋白。

这种分类过于粗糙。

例如经典CLIP研究的是蛋白质-RNA互作，却通常使用254nm；PAR-CLIP同样研究RNA-蛋白互作，但通常使用365nm和光反应核苷。

如果目前还没有确定自己的项目应该使用哪个波长，可以先查看紫外交联仪254、302、365nm怎么选？波长与应用区别。

三、第三步：确认样品和载体是否真的适合目标波长

确认波长以后，下一步不是马上设置剂量，而是检查紫外光能不能真正到达实验目标。

需要确认：

• 样品是膜、细胞、培养皿、液体还是其他体系；

• 紫外光是否需要穿过培养皿盖；

• 是否需要穿过塑料板、玻璃或其他材料；

• 样品表面是否存在明显液层；

• 样品是否有折叠、重叠或遮挡。

特别需要注意：

“看起来透明”并不意味着材料对254nm、302nm和365nm具有相同透过率。

普通玻璃和各种塑料对不同紫外波长的透过性能差异很大。

如果紫外线需要穿过容器以后才能到达样品，应提前确认材料在目标波长下的透光特性。

关于膜、培养皿、液体及容器的具体要求，可以查看紫外交联仪对样品有哪些要求？膜样品与操作要点。

四、第四步：如果是膜样品，先把膜正确放好

Southern、Northern等膜交联是紫外交联仪最常见的操作之一。

进入曝光室以前建议检查：

• 膜材和实验协议是否支持UV固定；

• 膜面是否平整；

• 是否存在折叠、卷曲或两张膜重叠；

• 核酸所在膜面方向是否符合实验协议；

• 膜表面是否存在大量液滴或明显缓冲液积聚；

• 干膜还是湿膜是否按照当前膜材说明执行。

这里不能统一规定：

“所有膜必须完全晾干”

或者：

“所有膜必须保持湿润”。

不同膜材及实验协议可能有不同要求，应优先按照所使用膜的说明书和已经验证的方法操作。

图2：Southern Blot核酸膜示例。紫外交联前需要确认膜材、核酸面方向、膜状态及实际固定方案。

五、第五步：确认使用能量模式还是时间模式

紫外交联仪常见的两种核心控制方法是：

1. 能量模式

直接设置目标累计紫外剂量，例如以mJ/cm²表示。

设备持续测量紫外输出，累计剂量达到目标以后结束照射。

这种模式更加适合：

• 长期重复的核酸膜固定；

• CLIP、PAR-CLIP等需要记录UV剂量的实验；

• 剂量—效应研究；

• 需要进行不同批次定量比较的项目。

2. 时间模式

直接设置紫外灯运行多长时间。

适用于已经通过实验验证、并明确以固定时间执行的流程。

但应注意：

相同照射时间不一定永远对应完全相同的紫外剂量。

因为灯管状态和实际UV输出可能随长期使用发生变化。

如果对mJ/cm²、mW/cm²和秒之间的关系还不清楚，可以查看紫外交联仪能量和时间怎么设？UV剂量换算与模式选择。

六、不要把mJ/cm²叫做“紫外强度”

这是旧版362中一个需要明确纠正的地方。

mJ/cm²代表的是累计紫外剂量，而不是瞬时紫外强度。

紫外辐照强度通常使用：

• W/cm²；

• mW/cm²；

• μW/cm²。

累计剂量通常使用：

• J/cm²；

• mJ/cm²；

• μJ/cm²。

两者之间的基本关系是：

剂量 = 辐照强度 × 时间

因此操作记录中应该写“目标剂量120mJ/cm²”，而不是“紫外强度120mJ/cm²”。

七、第六步：剂量从哪里来？不要凭经验随便输入

设备参数输入以前，建议按照下面的优先级确定初始条件：

1. 当前实验方法或标准协议；

2. 所使用膜材、试剂或实验体系的厂家说明；

3. 与自己样品高度接近的可靠文献；

4. 实验室已经验证成功的历史SOP；

5. 必要时再进行小范围剂量梯度。

不要按照：

“DNA全部120～200mJ/cm²、蛋白全部80～150mJ/cm²”

这种方式统一设置。

例如同样属于254nm核酸膜交联，不同膜材料、膜状态和实验方法本身就可能采用不同剂量。

如果当前问题专门是Southern、Northern膜固定到底应该使用多少254nm剂量，可以查看254nm紫外交联剂量怎么设？膜固定参数与排查。

八、第七步：把样品放在有效曝光区域，而不是“能塞进去就行”

样品进入曝光室以后，应保证：

• 完整处于设备规定的有效曝光区域；

• 尽量平整；

• 样品之间不要重叠；

• 不同平行样品尽量保持相似空间位置；

• 需要长期比较的项目固定每次摆放方式。

如果是较大膜、多培养皿或者多个平行样品，更应该注意曝光区域内UV分布是否均匀。

图3：254nm UVC曝光区域多点实测示例。长期定量实验应尽量固定样品位置和摆放方式。

设备显示已经达到目标剂量，并不能自动保证一个被其他样品覆盖的位置也获得相同紫外照射。

九、第八步：关闭曝光室后再启动UV照射

完成波长、模式、参数和样品确认以后，再启动设备。

操作前建议最后核对一次：

• 波长是否正确；

• 单位是否正确；

• 能量还是时间模式是否选对；

• 样品方向是否正确；

• 样品是否位于有效曝光区域；

• 设备曝光室是否正常关闭。

确认无误以后再开始紫外照射。

照射过程中不要为了观察样品而绕过设备的安全防护结构，也不要直接暴露于UVA、UVB或UVC光源。

十、第九步：运行结束以后，不要统一增加“80℃烘30分钟”

旧版文章写成：

“DNA交联膜取出以后需要80℃烘箱干燥30分钟增强结合。”

这不能作为所有UV膜固定实验的标准步骤。

紫外交联和烘烤固定本身属于不同的核酸固定策略，具体是否需要后续加热处理，应以所使用膜材和实验方法为准。

所以紫外照射结束以后正确的处理方式应该是：

按照当前实验协议直接进入规定的下一步。

例如：

• 膜杂交实验进入后续预杂交或保存步骤；

• CLIP进入裂解、RNase处理和免疫沉淀等后续流程；

• UV损伤实验进入规定的恢复培养或检测时间点；

• 其他光化学实验按照对应方案继续处理。

不要自行给所有实验增加同一种“强化固定”步骤。

十一、第十步：记录这次实际实验条件

真正提高重复性的关键不是“记住怎么按设备”，而是把这次实验完整记录下来。

建议至少保存：

如果某个实验条件以后验证稳定，再把它保存成固定程序，比每一次重新输入更加容易形成SOP。

十二、以VL-3000为例，实际操作逻辑是什么？

如果实验室同时存在254nm、302nm和365nm项目，可以使用VL-3000三波长紫外交联仪这类多波长平台。

当前VL-3000的基本操作逻辑就是四步：

1. 选择波长：254nm、302nm或365nm；

2. 设置参数：选择能量、时间或已经保存的程序；

3. 放置样品：将膜、培养皿或相应实验样品放入有效曝光区域；

4. 启动运行：达到设定能量或时间以后结束照射。

图4：VL-3000三波长紫外交联仪，可根据实验方法选择254nm、302nm或365nm，并使用能量、时间或已保存程序完成UV照射。

当前VL-3000支持自动、能量、时间和程序调用模式；能量模式按照mJ/cm²累计实际紫外剂量，达到目标值后自动停止。对于需要不同批次比较的实验，更适合优先采用经过验证的能量条件。

十三、操作完成以后，设备应该怎么维护？

日常维护的重点并不是给所有设备规定“每月必须通电一次”，而是保持曝光室清洁，并按照具体设备说明维护UV光源和检测系统。

建议：

• 实验结束后清理曝光室内的液体和污染物；

• 避免盐、缓冲液和有机残留长期留在设备内部；

• 不要使用可能损伤内腔或光学部件的强腐蚀清洁剂；

• 定期检查紫外灯管工作状态；

• 如果长期定量使用，应按照设备要求进行能量检测或校准；

• 灯管更换后重新确认原有程序的实际输出状态。

长期实验真正应该维护的是实际UV输出的可重复性，而不是只看灯管还能不能发光。

十四、紫外交联使用中最常见的8个错误

错误1：还没确认实验方法就直接选择254nm

254nm非常常用，但PAR-CLIP、UVB损伤等实验并不使用相同波长。

错误2：把mJ/cm²写成紫外强度

mJ/cm²是累计剂量，mW/cm²才属于辐照强度单位。

错误3：所有实验统一套120mJ/cm²

不同膜、CLIP、UV损伤和光敏体系需要分别建立条件。

错误4：只记录照射时间

长期项目如果需要定量比较，最好记录波长和实际累计剂量。

错误5：样品重叠

被遮挡区域无法获得与上层相同的紫外暴露。

错误6：默认透明培养皿盖可以透过所有UV

不同材料对UVA、UVB、UVC透过率不同，需要确认。

错误7：UV结束以后所有膜统一再烘烤

后续处理应按照膜材和具体实验协议执行。

错误8：结果不好只继续增加UV剂量

信号弱、交联不足或结果异常还可能来自样品、膜材、探针、容器、位置以及后续检测流程。

十五、一张表看懂紫外交联仪标准操作顺序

总结：紫外交联仪真正的使用方法，不是“设个时间按启动”

规范使用紫外交联仪，最重要的是把设备操作放回具体实验体系中。

正确顺序应该是：

实验目的 → 波长 → 样品和载体 → 剂量/时间 → 样品位置 → UV照射 → 后续实验 → 完整记录。

设备负责稳定执行已经确定的UV条件，但不会自动判断某个膜、某种细胞或者某种RNA-蛋白体系的最佳剂量。

如果现在卡在波长不知道怎么选，查看254、302、365nm紫外交联仪怎么选；如果卡在mJ/cm²和照射时间不知道怎么换算，查看紫外交联仪能量和时间怎么设；如果正在做254nm核酸膜固定，则查看254nm紫外交联剂量怎么设。