使用大肠杆菌等原核细胞进行外源基因表达，看起来只是“把一个质粒转进去，然后诱导表达”，但真正决定实验能否成功的其实是一条完整链路。

这条链路至少包括：

表达载体设计 → 外源DNA导入宿主 → 阳性克隆筛选 → 质粒或插入片段验证 → 扩增培养 → 诱导表达 → 蛋白检测与后续纯化。

其中任何一个环节出现问题，都可能表现为“没有菌落”“有菌落但不表达”“表达量低”“蛋白主要形成包涵体”或者“不同批次结果不稳定”。

因此，原核表达不能简单理解成质粒进入细胞。转化成功解决的是DNA有没有进入并保留在宿主中，而基因表达解决的是进入以后能不能被正确转录、翻译并产生目标蛋白。

一、原核细胞外源基因表达，最常用的路线是什么？

实验室中最常见的原核表达体系通常以大肠杆菌为宿主，通过表达质粒携带目标基因。

一套典型流程可以概括为：

1. 将目的基因构建到适合原核表达的质粒中；

2. 将表达质粒导入对应宿主菌；

3. 通过抗性等方式筛选获得质粒的菌落；

4. 进行菌落PCR、酶切或测序等验证；

5. 挑取正确克隆进行扩大培养；

6. 根据表达系统加入相应诱导条件；

7. 检测目的蛋白是否表达以及是否可溶；

8. 根据实验目的进行蛋白纯化或后续功能分析。

所以真正需要优化的不只是“转化效率”，而是从DNA导入一直到目标蛋白获得的整个过程。

二、第一步不是电转，而是确认表达质粒设计正确

一个普通克隆质粒能够在细菌中复制，并不意味着它一定能够高效表达目标蛋白。

用于原核蛋白表达的载体通常需要具备几个关键元件：

• 复制起点（ori）：决定质粒能否在对应宿主中复制和维持；

• 筛选标记：常见为抗性基因，用于筛选获得质粒的细胞；

• 启动子：决定目标基因能否被转录以及在什么条件下表达；

• 核糖体结合位点（RBS）：参与细菌翻译起始；

• 目标基因：需要确保阅读框、序列和宿主体系匹配；

• 终止元件：帮助形成完整、稳定的转录单元；

• 必要的融合标签：例如His标签，可用于后续检测和纯化。

例如常见pET类表达载体使用T7启动子进行目标基因表达，因此还必须考虑所使用宿主是否具有与该系统相匹配的T7 RNA聚合酶表达体系。

图1：原核表达质粒示意图，可见启动子、RBS、抗性标记、复制起点等表达载体核心元件。图片来源：Wikimedia Commons。

三、“质粒转进去”和“目标蛋白表达”是两个不同问题

原核表达实验排查时，一个非常重要的思路就是把问题分成两个阶段。

第一阶段：质粒有没有成功进入宿主？

这一阶段属于转化问题。

如果转化以后没有获得预期菌落，应优先检查：

• 感受态细胞状态；

• 质粒质量及盐离子残留；

• 抗生素类型是否和质粒抗性标记对应；

• 电转或化学转化条件；

• 复苏和培养流程；

• 培养基及平板是否正常。

第二阶段：正确质粒进入以后有没有产生目标蛋白？

如果已经能够稳定获得正确阳性克隆，但检测不到目标蛋白，这时继续反复提高电转效率通常没有意义。

问题更可能出现在表达载体、宿主菌株、诱导条件、目标蛋白稳定性或检测方法等环节。

把这两个阶段分开，可以避免一个很常见的误区：表达量低，就继续调整电转参数。

四、为什么很多原核实验会选择大肠杆菌？

大肠杆菌是应用非常成熟的原核实验宿主之一，培养周期较短，遗传操作体系完善，并且具有大量已经建立的克隆和蛋白表达载体。

不过“都是大肠杆菌”并不代表不同菌株功能完全相同。

实验中通常需要根据目的区分：

• 克隆宿主：更强调质粒扩增和遗传稳定性；

• 表达宿主：更强调目标基因转录、翻译及蛋白生产；

• 特殊表达菌株：用于解决稀有密码子、蛋白毒性、二硫键形成或其他特定表达问题。

因此，一个质粒在克隆菌中扩增正常，并不代表直接换到任意表达菌株中就一定能获得理想蛋白。

图2：大肠杆菌扫描电子显微镜图像。图片来源：NIAID / Wikimedia Commons。

五、怎样把表达质粒导入原核细胞？

获得正确表达质粒以后，下一步才是把DNA导入宿主菌。

实验室常见方法包括化学转化和电转化。

1. 化学转化

对于部分常规克隆实验，化学感受态体系已经能够满足使用需求，操作流程成熟，也不需要专门的电转设备。

2. 电转化

电转化利用短时间电脉冲暂时改变细胞膜通透性，使质粒DNA进入细胞。

对于需要较高转化能力、特定菌株或者实验室已经建立稳定电转体系的情况，可以采用电穿孔方法。

需要注意的是，细菌电转结果不仅取决于设备电压，还会受到感受态质量、DNA纯度、样品盐离子、电转杯电极间距、脉冲波形以及复苏条件等共同影响。

如果还不清楚“电转染”和“电转化”之间的区别，可以查看电转染和电转化怎么选？从样品类型到电穿孔仪选型指南。

图3：电穿孔通过短时电脉冲暂时提高细胞膜通透性，为外源DNA进入细胞提供通道。

六、电转完成以后，为什么不能马上判断表达成功？

电转以后首先得到的是“可能已经获得质粒的细胞”，并不是已经确认完成外源基因表达。

之后还要经过复苏和选择培养。

抗生素筛选只能说明菌落具备相应选择标记，并不能完全证明目标插入片段、方向和序列都正确。

因此，正式进入表达实验之前通常还需要根据构建策略进行确认，例如：

• 菌落PCR；

• 质粒提取后酶切验证；

• 测序确认目标序列；

• 确认插入方向和阅读框。

如果这一步没有做好，后面即使培养、诱导全部按照计划执行，也可能因为质粒构建本身错误而无法得到目标蛋白。

七、为什么阳性克隆正确，目标蛋白还是不表达？

当质粒和插入序列都已经确认正确以后，问题才真正进入“表达阶段”。

这时重点可以从以下几个方面排查。

1. 启动子和宿主是否匹配

表达载体需要能够被当前宿主的转录体系识别。

例如使用依赖T7 RNA聚合酶的表达系统时，就要确保宿主菌与该表达机制匹配。

2. 诱导条件是否合理

诱导剂浓度、开始诱导时的菌体状态、诱导时间和培养温度都会影响最终表达。

不能简单认为诱导越强、时间越长，目标蛋白就一定越多。

过强表达可能明显增加宿主代谢负担，甚至造成蛋白错误折叠和包涵体增加。

3. 目标序列是否适合宿主表达

不同生物之间存在密码子使用偏好差异。

如果目的基因中包含较多当前宿主低频使用的密码子，可能影响翻译效率。根据具体项目，可以考虑选择对应宿主菌株或者重新进行序列设计。

4. 目标蛋白是否稳定

有些蛋白容易被宿主蛋白酶降解，或者具有较强毒性，可能导致表达量偏低甚至影响细胞生长。

八、为什么“表达很多”不等于“得到可用蛋白”？

重组蛋白实验还经常遇到另一种情况：SDS-PAGE上可以看到非常明显的目标条带，但目标蛋白主要存在于不溶性沉淀中。

这类情况常涉及包涵体。

所以表达结果不能只判断“有没有目标条带”，还要进一步区分：

• 总蛋白中目标蛋白是否增加；

• 目标蛋白主要位于可溶性组分还是沉淀组分；

• 蛋白是否保持预期结构和功能；

• 后续是否能够完成纯化。

如果表达量高但可溶性非常差，可以进一步围绕诱导强度、诱导温度、培养时间、宿主菌株和融合标签等方向进行优化。

九、染色体整合也是原核细胞表达外源基因的一条路线

原核外源基因表达并不只有质粒这一种方式。

对于需要长期保持遗传稳定性或者降低质粒维持压力的项目，也可以将外源表达单元整合到宿主染色体中。

与质粒体系相比，染色体整合具有不同特点：

• 外源基因能够随染色体稳定遗传；

• 不依赖高拷贝质粒长期维持；

• 表达量和调控方式取决于插入位置、拷贝数及表达元件；

• 构建和验证过程通常更加复杂。

因此，它更适合特定的菌株工程、代谢工程或长期稳定表达项目，而不是简单替代所有常规质粒表达实验。

十、噬菌体相关元件不能简单理解成“把基因整合进去”

旧文章中将噬菌体表达系统统一描述成“利用病毒载体将外源基因整合到宿主基因组”，这种说法并不准确。

在现代原核表达体系中，噬菌体来源的元件可以有不同用途。

例如实验室常见T7表达体系的关键，是利用T7 RNA聚合酶识别T7启动子并实现高效转录；这并不等于每次使用T7系统都要把目标基因通过噬菌体整合进入细菌染色体。

所以判断表达系统时，应该具体查看所使用载体和宿主的遗传结构，而不能只根据“噬菌体来源”几个字判断工作机制。

十一、原核表达实验失败，可以按照哪条路径排查？

这种排查方式比看到“蛋白没出来”以后从头修改所有参数更加有效，因为每一个实验现象对应的故障环节并不相同。

十二、如果问题出在细菌电转化，设备应该关注什么？

对于长期进行大肠杆菌、农杆菌、酵母或其他微生物外源DNA导入的实验室，电穿孔设备真正需要解决的是脉冲稳定、参数可调、异常能够判断以及实验条件可以复现。

细菌和酵母等微生物电转中常见指数衰减波体系，因此设备除了输出电压，还可以关注电阻、电容、时间常数、实际波形以及样品放电状态。

Gene Pulser 630指数衰减波电穿孔仪主要面向大肠杆菌、农杆菌、酵母和真菌等微生物电转化，支持电压、电阻、电容及时间常数设置，并可实时显示实际电压、时间常数和波形曲线。

图4：Gene Pulser 630指数衰减波电穿孔仪，主要用于细菌、酵母及真菌等微生物电转化实验。

需要特别强调，电穿孔设备只负责整个原核表达流程中的“外源DNA导入”环节。高转化效率能够提高获得目标克隆的机会，但最终有没有目标蛋白，仍然取决于表达载体、宿主菌株和后续培养诱导体系。

如果需要进一步进行细菌电转条件筛选，可参考电转参数优化怎么做？梯度设计、变量控制与结果判断，把电转化参数和后面的蛋白表达条件分开优化。

十三、原核外源基因表达，建议建立完整实验记录

如果一个蛋白项目需要持续数月甚至更长时间，建议不要只记录“最终用了多少IPTG”或者“电转用了多少伏”。

更有价值的实验记录应该覆盖：

• 表达载体名称及版本；

• 目标基因及标签设计；

• 宿主菌株；

• 转化方式和电转条件；

• 阳性克隆验证结果；

• 培养及诱导条件；

• 目标蛋白总表达情况；

• 可溶性和不溶性比例；

• 最终纯化或功能检测结果。

这样下一次实验出现异常时，才能判断究竟是质粒导入出了问题，还是培养和表达条件发生了变化。

总结：原核外源基因表达是一条链路，不是一次“转进去”就结束

原核细胞实现外源基因表达，可以把整个过程理解为两个大的阶段。

第一阶段是把正确的外源DNA送进正确的宿主，并获得可靠的阳性克隆；第二阶段才是让这个基因稳定转录、翻译并最终获得可用的目标蛋白。

质粒设计、宿主选择、电转化、克隆验证、诱导条件以及蛋白折叠都可能成为最终结果的限制因素。

因此，当实验失败时，不建议笼统地归结为“表达效率低”，而应该先判断问题发生在DNA导入、克隆筛选、转录、翻译还是蛋白稳定性中的哪一步。

如果当前主要问题是大肠杆菌、农杆菌或酵母的质粒电转化，可以查看Gene Pulser 630指数衰减波电穿孔仪；如果还需要进一步优化电脉冲条件，可继续查看电转参数优化实验设计方法。