白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）是小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）研究中非常重要的细胞因子之一。在经典含血清培养体系中，LIF可通过LIFR/gp130受体复合物激活JAK/STAT3等信号通路，参与维持小鼠ES细胞的自我更新和未分化状态。

因此，在早期胚胎干细胞研究中，研究人员曾通过LIF基因过表达和反义LIF RNA等方式，直接改变ES细胞自身的LIF表达水平，观察其对细胞生长、未分化状态和分化倾向的影响。

但需要注意，LIF作用具有明显的物种和培养体系差异。这里讨论的经典结论主要针对小鼠ES细胞，不能简单推广到人胚胎干细胞或所有多能干细胞体系。

一、LIF为什么能影响小鼠ES细胞自我更新？

LIF与细胞表面的LIF受体结合后，会与gp130形成受体复合物，并激活下游JAK激酶。随后STAT3发生磷酸化、二聚化并进入细胞核，调节一系列与小鼠ES细胞自我更新有关的基因表达。

在经典小鼠ES细胞培养体系中，JAK/STAT3被认为是LIF维持未分化状态的重要信号轴之一。

与此同时，LIF还能够影响PI3K/AKT以及SHP2/MAPK等信号通路。不同信号之间的平衡共同决定细胞更倾向于维持自我更新，还是进入分化过程。

二、经典LIF基因转染研究做了什么？

1996年发表的一项研究以ES-5胚胎干细胞为模型，分别构建含有人LIF cDNA正义方向和反义方向的表达质粒pSVLD(+)与pSVLD(-)，随后将其转染进入ES-5细胞，并通过G418进行稳定转染克隆筛选。

这项实验实际上设计了两个相反方向的研究模型：

• LIF过表达：观察细胞自身产生更多LIF以后，能否降低对培养体系中外源LIF的依赖；

• LIF表达抑制：通过反义LIF RNA降低内源LIF作用，观察ES细胞是否更容易进入分化状态。

这种设计的价值在于，它不是单纯向培养基添加不同浓度的LIF，而是直接通过基因表达调控研究LIF在ES细胞内部和局部环境中的作用。

三、LIF过表达以后，小鼠ES细胞发生了什么？

研究获得的ESL(+)A2细胞具有较强的LIF表达。在不额外添加外源LIF的条件下，该细胞能够连续传代至少13代，同时仍保持未分化形态、较高增殖能力以及研究中检测到的多能性相关特征。

这个结果说明，在该ES-5细胞模型和当时采用的培养体系中，细胞自身持续表达LIF能够在较大程度上替代培养体系中的外源LIF支持。

但这里非常重要的一点是：“连续传代13代”是该项特定研究的实验结果，而不是所有LIF转染ES细胞都会获得的固定结果。

不同ES细胞系、载体、表达水平、培养体系以及筛选条件发生变化以后，结果都可能不同。因此，不应把这一数字直接作为现代干细胞转染实验的通用性能指标。

四、降低内源LIF表达为什么会增加分化倾向？

与LIF过表达组相反，表达反义LIF RNA的ESL(-)细胞对外源LIF表现出更明显的依赖。

当培养环境提供的LIF支持不足时，这类细胞更容易出现广泛分化。

研究中的ESL(-)B5细胞在诱导分化实验中也表现出与对照及LIF过表达细胞不同的细胞形态变化，包括更明显的成纤维样和梭形细胞出现。

这些结果支持一个基本判断：在经典小鼠ES细胞体系中，LIF信号强弱会影响自我更新与分化之间的平衡。

五、现代研究为什么不能简单理解为“ES细胞必须依赖LIF”？

随着多能干细胞培养体系的发展，人们对LIF作用的认识已经比早期研究更加完整。

首先，LIF依赖性具有明显的物种差异。

经典小鼠ES细胞可以依赖LIF/STAT3信号维持自我更新，而人胚胎干细胞并不能简单使用这一模式解释其多能性维持机制。因此，看到“ES细胞需要LIF”时，首先应该确认研究对象究竟是小鼠ES细胞还是人ES细胞。

其次，即使是小鼠ES细胞，培养体系也会改变其对LIF的依赖程度。例如在部分无血清2i培养体系中，通过抑制特定分化相关信号，可以明显改变细胞对外源LIF的需求。

所以更准确的表述应该是：LIF是经典小鼠ES细胞自我更新调控的重要因子之一，其实际作用需要结合细胞系、培养体系和其他信号共同判断。

六、做ES细胞基因转染时，不能只看“基因有没有进去”

对于胚胎干细胞、诱导多能干细胞以及其他敏感细胞来说，转染实验的评价方式与普通易转染细胞存在明显不同。

如果实验目的是导入LIF表达质粒、报告基因、基因编辑相关分子或者其他外源核酸，仅仅获得较高阳性率并不代表实验条件一定合理。

通常还需要同时关注：

• 外源分子的导入或表达效率；

• 转染后的细胞活率；

• 细胞恢复和增殖情况；

• 克隆形态是否发生明显改变；

• OCT4、SOX2、NANOG等多能性相关指标；

• 必要时检测碱性磷酸酶等表型；

• 后续分化能力是否受到明显影响。

尤其对于干细胞实验，如果通过非常强的转染条件获得较高瞬时表达，却导致大量细胞死亡或使细胞状态发生不可逆改变，最终并不一定能得到理想实验结果。

七、为什么干细胞电转染要同时平衡效率和活率？

电穿孔可以通过短暂电脉冲增加细胞膜通透性，将质粒DNA、mRNA、蛋白或其他外源分子递送进入细胞。

对于干细胞等相对敏感的样品，电脉冲强度、脉冲宽度、脉冲次数、电转缓冲体系以及细胞状态都会影响最终结果。

参数过于温和时，外源分子导入不足；参数过强时，则可能导致细胞活率下降以及恢复困难。

因此，干细胞电转的目标一般不是单纯寻找“最高转染率”，而是寻找一个兼顾转染效率、细胞活率、恢复能力和后续功能状态的实验窗口。

如果实验中存在“同一参数在文献中有效，但自己的细胞效果很差”的情况，可以进一步查看复制电穿孔参数为什么失败？从细胞状态、电转杯、缓冲体系和脉冲参数等方面逐项排查。

八、LIF基因转染实验应该怎样评价结果？

如果实验目的不仅是实现LIF质粒导入，而是研究LIF表达对ES细胞自我更新或分化的实际影响，就需要把“转染结果”和“生物学结果”分开评价。

第一层：确认外源基因是否成功导入。

可以根据实验设计检测报告基因、LIF mRNA或蛋白表达，判断目的基因是否成功进入并表达。

第二层：观察细胞本身是否能够正常恢复。

重点查看转染后细胞活率、贴壁或克隆恢复、增殖情况以及形态变化。

第三层：判断多能性状态是否发生变化。

通过多能性相关标志物、细胞形态及其他验证手段，判断细胞是否仍保持预期的未分化状态。

第四层：进行分化相关验证。

如果研究目标涉及LIF对分化的调控，还需要在适当的分化条件下比较不同实验组之间的变化，而不能只依赖一次转染后的表达水平进行判断。

九、干细胞电转设备应该重点看哪些能力？

如果实验室长期进行胚胎干细胞、原代细胞或其他真核细胞转染，设备选型重点通常不是最大输出电压，而是能否对电脉冲进行更细致的控制。

需要关注的能力包括：

• 是否适合真核细胞方波电转；

• 电压与脉冲时间是否能够独立调节；

• 是否支持多个脉冲以及脉冲间隔设置；

• 实际脉冲输出是否能够显示和记录；

• 是否具备电阻检测及异常放电保护；

• 不同实验条件是否方便保存和重复调用。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪主要面向哺乳动物细胞、原代细胞、干细胞及其他真核细胞转染，可分别控制方波脉冲强度、时间、间隔和脉冲个数，并支持实际波形显示、实验方案保存和历史记录查询。

对于ES细胞等敏感样品，这类参数控制能力的实际价值在于方便研究人员逐步比较不同电转条件，而不是依赖一套固定的“万能参数”。

如果还不确定自己的实验属于细胞电转染还是微生物电转化，也可以查看电转染和电转化怎么选？先根据实验对象和递送分子确定设备方向。

十、为什么不建议直接复制其他ES细胞的电转参数？

即使都是胚胎干细胞，不同细胞系的状态和电脉冲耐受性也可能存在差异。

此外，质粒DNA、mRNA以及基因编辑相关分子的大小、结构和递送目的不同，也可能改变最佳实验窗口。

因此，参考文献时建议同时记录：

• 具体细胞系；

• 培养状态和传代情况；

• 导入分子类型；

• 电转杯电极间距；

• 细胞数量和样品体积；

• 使用的缓冲体系；

• 波形类型；

• 电脉冲强度、宽度和次数；

• 转染后的恢复条件；

• 转染效率、活率以及多能性评价结果。

只有这些实验条件具有较高可比性时，其他研究的参数才更具有参考意义。

总结：LIF基因转染研究的重点是自我更新与分化平衡

经典LIF基因转染研究证明，在特定小鼠ES细胞模型中，提高LIF表达能够降低细胞对外源LIF的依赖，而抑制内源LIF表达则会增加细胞的分化倾向。

这些研究帮助人们进一步认识了LIF及其下游JAK/STAT3等信号在小鼠胚胎干细胞自我更新中的作用。

但随着培养体系和多能干细胞研究不断发展，现在已经不能把“ES细胞依赖LIF”理解成适用于所有物种和所有培养条件的固定结论。

对于实际干细胞基因转染实验而言，更重要的是同时评估外源分子导入效率、细胞活率、恢复状态和多能性，而不是只追求一个较高的瞬时转染率。

如需开展胚胎干细胞、原代细胞及其他真核细胞电转染，可进一步查看Gene Pulser 830方波电穿孔仪及电穿孔仪产品系列， 根据具体细胞、递送分子和效率/活率需求选择相应电转平台。

参考研究

1. Du XX, Shi WK. Study on growth and differentiation of ES cells transfected with LIF gene. 1996. PMID: 9772686.

2. Ohtsuka S, Nakai-Futatsugi Y, Niwa H. LIF signal in mouse embryonic stem cells. JAK-STAT. 2015. PMID: 27127728.

3. Okita K, Yamanaka S. Intracellular signaling pathways regulating pluripotency of embryonic stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2006. PMID: 18220859.