电转完成以后，显微镜下一看，细胞碎片明显增加；恢复一段时间以后检测活率，又比未电转对照低很多；继续培养，细胞数量增长缓慢，甚至进一步死亡。

遇到这种情况，很多实验人员首先想到的是：

“是不是电压太高了？”

有可能，但如果只围绕电压反复调整，很容易连续做几轮实验以后仍然找不到真正原因。

因为电转后细胞大量死亡可能发生在电脉冲之前、脉冲过程中，也可能出现在电转后的恢复培养阶段。

更加有效的排查方法不是先猜某一个参数，而是先确定：

细胞到底从实验流程的哪一个环节开始出现异常？

一、先看死亡发生在什么时候

同样都是“电转后细胞死了很多”，实际可能对应完全不同的问题。

先把死亡出现的时间点确定下来，可以大幅缩小后面的排查范围。

二、先用对照确定：问题是不是在电转之前已经出现

有些实验最后表现为电转后大量死亡，但真正的问题其实在按下脉冲以前就已经开始。

例如细胞近期刚刚复苏、培养状态异常、消化或分离过程刺激较大、离心次数增加、重悬过程过于剧烈，或者电转前活率本身就已经下降。

这种情况下，电脉冲只是给状态较差的细胞再次增加了一次刺激。

因此建议至少保留一个未电转处理对照：

• 使用相同批次细胞；

• 进行相同的收集、离心和重悬；

• 保持相近的操作等待时间；

• 但不施加电脉冲。

如果未电转处理组的活率也明显下降，就不能把全部问题归到电穿孔参数上。

如果未电转组状态良好，而电脉冲组明显下降，再把重点转向电参数、缓冲体系和样品条件。

三、效率很高、活率很低，要先怀疑总体刺激过强

电穿孔的基本目标，是利用电脉冲暂时提高细胞膜通透性，使质粒DNA、mRNA、RNP、蛋白或者其他外源物能够进入细胞。

但电脉冲本身存在一个明显的平衡关系。

刺激不足时，外源物递送效率可能偏低；随着有效刺激增加，递送效率可能提高；如果继续增加刺激，则可能进一步增加不可逆细胞损伤。

因此，如果实验表现为：

转染或者递送效率已经比较高，但是细胞活率明显下降，

下一轮实验的重点通常不应该继续追求更强脉冲，而是判断当前条件是否已经超过了这批细胞的合适工作窗口。

如果目前的问题刚好相反——细胞活率尚可，但转染效率始终偏低，可以进一步查看电穿孔转染效率低怎么办？先排查这6个关键变量，不要把两类问题混在一起调整。

四、降低电压不是唯一解决办法

“细胞死亡多，那我下一次把电压降低一些”是非常常见的处理方式。

但电刺激并不是由一个电压数字单独决定。

对于方波电转，需要综合考虑脉冲强度、脉冲持续时间、脉冲次数以及脉冲间隔。

对于指数衰减波体系，还可能涉及电容、电阻以及时间常数等条件。

此外，电转杯电极间距变化以后，相同电压对应的电场条件也会发生变化。

所以出现高死亡率以后，更准确的问题不是：

“我要降低多少伏？”

而应该是：

“怎样在尽量维持所需递送效率的情况下，降低不必要的总体电刺激？”

具体需要怎样建立电压、脉冲时间和脉冲次数的小范围梯度，可以继续查看电转参数优化怎么做？电压、脉宽与脉冲次数如何调整。

五、以前一直正常，突然死亡增加，要检查样品体系

如果同一组参数过去长期能够正常使用，最近突然出现细胞死亡明显增加，那么第一反应不应该一定是“仪器参数失效了”。

应该把最近一次实验和历史成功实验逐项比较。

重点检查：

• 电转缓冲体系是否更换；

• 试剂或缓冲液批次是否变化；

• 细胞重悬以后等待时间是否延长；

• 样品总体积是否改变；

• 细胞数量和浓度是否保持一致；

• 递送物加入量是否发生变化；

• 递送物原液是否带入较多盐或其他成分；

• 电转杯规格是否与以前一致；

• 样品中是否存在明显气泡或异常。

电脉冲真正作用的是电转杯中的完整样品体系。

因此，即使设备面板上显示完全相同的参数，只要样品体系明显变化，两次实验也不能简单理解为处在完全相同的电转条件下。

六、不要忽略质粒DNA、mRNA或RNP本身

还有一种常见情况：

设备没有变化，细胞名称没有变化，电脉冲参数也没有变化，但更换递送物或者更换一批样品以后，细胞活率突然下降。

这时需要增加一个判断：

细胞损伤究竟主要来自电脉冲，还是递送物和样品体系增加了额外负担？

可以根据实验情况增加无递送物电转对照，使细胞接受相同电脉冲，但不加入目标递送物。

如果无递送物电转组状态明显更好，而加入递送物以后活率下降，就需要进一步检查递送物质量、加入量以及它对整个电转体系的影响。

对于原代细胞、T细胞、NK细胞、PBMC以及其他敏感样品，这种区分尤其重要。

如果目前主要进行的是原代细胞或者免疫细胞实验，还可以参考原代细胞、免疫细胞电转参数优化：为什么不能照搬普通细胞系？。

七、电转结束以后，实验还没有结束

不少实验人员把大部分注意力都集中在按下“Pulse”以前，却忽略了电转完成以后的恢复过程。

实际上，电脉冲结束以后，细胞仍然处于恢复阶段。

如果这个阶段不同批次之间存在较大差异，同样可能造成最终活率发生变化。

需要尽量稳定的项目包括：

• 电转结束后的处理节奏；

• 恢复培养体系；

• 细胞转移和混匀方式；

• 接种密度；

• 培养环境；

• 检测时间点。

这里不建议机械套用一个适合所有细胞的固定恢复时间或者固定温度。

不同细胞类型、实验体系和递送物需要根据实际方案验证。真正需要做到的是：一旦确认当前方案有效，就把关键恢复条件记录下来，并在重复实验中保持一致。

八、不要只看“刚电完”的细胞状态

有些细胞在电转结束以后立即观察时看起来没有明显异常，但经过一段时间以后才逐渐表现出损伤。

也有部分实验中，细胞短期形态受到一定影响，但经过恢复以后状态逐渐改善。

因此判断某组参数是否合适，最好根据实验目的设置多个有意义的观察节点，而不是只看一个时间点。

电转条件评价不能只看转染效率，还需要在合适时间点检测细胞活率

图片：7-AAD细胞活率检测示意，Wikimedia Commons，CC0

比较实验条件时，可以同步记录电转前活率、电转后的即时状态、恢复后的细胞数量、后续活率、增殖情况以及最终功能指标。

7-AAD等活率检测方法可以用于区分活细胞与膜完整性受损的死亡细胞，从而帮助量化不同条件下的细胞存活情况。

九、判断参数好坏，要把效率和活率放在一起

如果实验室长期只记录“阳性率多少”，就很容易把一组并不适合后续实验的条件误认为最佳参数。

例如某组条件获得很高的阳性比例，但大量细胞死亡；另一组条件阳性率稍低，却保留了更多能够继续培养和完成后续实验的细胞。

对于很多基因编辑、原代细胞和长期培养实验而言，后者可能更加有价值。

所以真正应该比较的是：

效率 × 活率 × 实际活细胞回收量 × 后续功能。

而不是简单执行“哪一组阳性率最高，就选择哪一组”。

十、什么情况下应该进一步检查设备输出？

如果细胞状态、递送物、缓冲体系、电转杯和恢复流程都能够基本保持一致，但实验仍然出现明显异常，就可以进一步增加设备端排查。

例如比较：

• 设置参数是否与历史实验一致；

• 实际输出是否符合预期；

• 样品电阻是否存在明显异常；

• 是否出现异常放电；

• 脉冲时间、次数和间隔是否正常执行。

对于以哺乳动物细胞、悬浮细胞、原代细胞等真核细胞转染为主，并且需要反复比较效率与活率的实验，可以进一步了解Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪——用于细胞转染参数、活率和实际脉冲状态的综合比较

Gene Pulser 830支持方波脉冲强度、时间、间隔和次数组合设置，同时能够显示实际电压、脉冲时间、间隔、个数和波形，并支持预脉冲样品电阻测量。

这些功能并不能替代细胞和样品优化，但在实验结果突然异常时，可以帮助实验人员增加一个设备端判断维度，把“设置了什么”和“实际执行了什么”对应起来。

十一、电转后细胞大量死亡，可以按这个顺序排查

1. 先看细胞：确认电转前活率、培养状态和批次是否正常。

2. 看对照：比较未电转处理组，判断死亡是否在电脉冲以前已经开始。

3. 看样品：检查递送物、缓冲体系、总体积、细胞浓度和电转杯。

4. 看电脉冲：不要只看电压，同时分析脉冲时间、次数、间隔和波形。

5. 看恢复：检查电转以后处理、接种和培养流程是否发生变化。

6. 看时间点：比较即时状态与后续活率，避免只凭一个时间点判断。

7. 最后综合效率和活率：选择能够得到足够可用细胞的条件，而不是只追求最高阳性率。

十二、仍然找不到原因时，咨询前把这些信息准备完整

如果已经进行了几轮实验，仍然出现电转后细胞大量死亡，与设备厂家或者技术人员沟通时，不建议只说：

“我的细胞电完以后死了很多，应该用多少伏？”

更加有价值的信息包括具体细胞类型、细胞来源、电转前活率、递送物类型及加入量、电转缓冲体系、样品总体积、电转杯规格、波形、电压、脉冲持续时间、脉冲次数、电转后不同时间点活率以及目前的递送效率。

例如：

“Jurkat细胞进行mRNA电转，电转前活率正常，目前阳性率较高，但24小时后活率明显下降。”

这样的实验信息，比单独提供一个细胞名称更容易判断问题究竟偏向脉冲刺激、样品体系还是恢复培养。

十三、电转后死亡率高，解决的是整个实验链条

电转后细胞大量死亡当然可能是电脉冲刺激过强，但真正的问题也可能出现在电脉冲以前或者电脉冲以后。

细胞初始状态、递送物、电转缓冲体系、电转杯、样品体积、脉冲组合、操作过程以及恢复培养都会共同影响最终活率。

所以真正有效的排查方式，不是一次次机械降低电压，而是通过对照和实验记录找到：

细胞从哪一个环节开始与历史成功实验出现差异。

确定问题节点以后，再针对性调整少数变量，通常比同时更换参数、缓冲液和操作流程更容易得到可解释的结果。

真正好的电转条件也不是单纯获得最高阳性率，而是在满足实验递送需求的同时，获得足够数量、能够继续培养并完成后续实验的有效细胞。