做siRNA实验时，经常会听到一句话：“这次转染效率有80%。”

但这个80%究竟代表什么？是80%的细胞出现了荧光，还是目标mRNA下降了80%，或者目标蛋白减少了80%？

这几个数字看起来都可以被称为“效率”，但实际上代表的是完全不同的实验环节。

对于siRNA实验来说，真正需要区分的至少包括siRNA递送效率、目标基因敲低效率、蛋白水平变化以及转染后细胞活率。如果只观察其中一个指标，很容易把“siRNA进入了细胞”误认为“RNA干扰已经成功”。

因此，与其单纯问“siRNA转染效率是多少”，更准确的问题应该是：siRNA有没有进去、目标mRNA有没有下降、蛋白有没有下降，以及细胞是否还能正常用于后续实验。

一、先区分三个容易混淆的“效率”

评价siRNA实验之前，建议首先把三个概念分开。

1. siRNA递送效率

主要回答：有多少细胞接触或获得了siRNA？

实验中常使用FAM、Cy3等荧光标记siRNA，通过荧光显微镜或流式细胞术观察阳性细胞比例。

这一指标适合用于判断转染体系有没有把核酸送进细胞，但不能直接证明目标基因已经被有效沉默。

2. 基因敲低效率

主要回答：目标基因表达到底下降了多少？

这是siRNA实验更加核心的指标。通常需要检测目标mRNA，必要时进一步检测目标蛋白。

3. 细胞活率

主要回答：获得递送和敲低效果以后，还有多少细胞处于可用状态？

特别是电穿孔实验，如果只追求高递送比例，很容易出现“阳性率提高了，但细胞大量死亡”的情况。

所以一次真正成功的siRNA实验，不应该只追求某一个数字最高，而应同时观察：

递送效果 + 基因敲低 + 细胞活率 + 实验重复性。

二、为什么看到荧光不能直接说明siRNA敲低成功？

荧光标记siRNA是一种非常直观的实验工具。

如果转染以后，大量细胞出现明显荧光，至少说明带有荧光标签的核酸已经与细胞发生接触，并在一定程度上进入细胞。

但这个结果仍然不能直接等同于RNAi成功。

原因在于siRNA真正发挥作用，需要进入合适的细胞内区域，并参与RNA诱导沉默复合物（RISC）相关过程，最终识别对应目标mRNA。

特别是在脂质体等化学转染体系中，一部分荧光信号可能来自细胞表面、内吞结构或者尚未有效释放到细胞质中的转染复合物。

因此，荧光阳性率更适合回答：

“递送发生了吗？”

而不是直接回答：

“目标基因被敲低了吗？”

图1：siRNA参与RNA干扰及RISC相关基因沉默过程示意。

三、评价siRNA敲低效果，首先看目标mRNA

siRNA发挥作用以后，最直接的实验结果之一就是目标mRNA水平发生变化。

常见方法是使用RT-qPCR检测目标基因表达。

实验中通常需要先使用合适的内参基因对样品进行归一化，然后再比较目标siRNA组与阴性对照组之间的相对表达量。

如果阴性对照组归一化后的相对表达量设为1，而目标siRNA组为0.30，那么可以理解为目标mRNA剩余约30%，对应的敲低程度约为70%。

简单表达可以写成：

敲低率（%）≈ [1－目标siRNA组相对表达量 ÷ 阴性对照组相对表达量] × 100%

不过这个计算成立的前提是样品检测和归一化方法本身可靠。

因此不能只看最终百分比，还需要确认：

• RNA提取质量是否稳定；

• 逆转录条件是否一致；

• 内参基因在当前实验条件下是否稳定；

• 引物是否能够正确检测目标转录本；

• 实验是否设置足够的技术和生物学重复。

图2：RNA逆转录并进行PCR扩增的基本过程，可用于理解siRNA实验中的mRNA检测逻辑。

四、为什么mRNA下降了，还需要继续检测蛋白？

siRNA实验最终研究的通常不是一个单独的RNA数字，而是目标基因功能发生改变以后产生的生物学结果。

因此，仅仅证明mRNA下降，有时仍然不够。

例如某个目标基因的mRNA已经明显降低，但它编码的蛋白本身半衰期比较长，细胞内原有蛋白仍然可以维持较长时间。

这时可能出现：

qPCR显示敲低明显，但Western Blot中的蛋白变化暂时并不突出。

因此，根据实验目的，可以进一步使用：

• Western Blot；

• 流式细胞术；

• ELISA；

• 免疫荧光；

• 其他适合目标蛋白的检测方法。

这里也不能规定所有siRNA实验必须统一在某一个固定小时数检测蛋白。

更加合理的做法是根据目标mRNA周转速度、目标蛋白半衰期、细胞增殖速度以及研究终点设计一个或多个检测时间点。

五、敲低率很高，但细胞死亡很多，这个结果算成功吗？

不一定。

这是电转染实验尤其容易出现的问题。

例如某个电脉冲条件下，目标mRNA下降80%，看起来敲低效果很好，但如果同时造成一半以上细胞死亡，那么剩余细胞可能已经不适合后续功能实验。

同时，大量细胞死亡本身也会影响转录、代谢和蛋白表达，使最终实验结果更加难以解释。

所以评价siRNA电转条件时，至少还应该同时记录：

• 转染前细胞活率；

• 电转后即时细胞状态；

• 恢复培养后的细胞活率；

• 实际存活细胞数量；

• 后续增殖及功能状态。

图3：7-AAD等活率染料可用于辅助评价电转后细胞膜完整性和细胞存活情况。

六、siRNA实验为什么一定要设置对照组？

没有合理的对照，很多所谓的“高效率”其实无法解释。

一个比较完整的siRNA实验可以根据实际研究目的考虑以下对照。

1. 未处理细胞组

用于观察没有进行任何转染操作时的细胞基础状态。

2. Mock对照

进行相同的转染或电转操作，但不加入目标siRNA。

如果Mock组本身已经出现大量细胞死亡或者表达变化，就说明问题可能来自转染试剂、电脉冲或者实验操作，而不是目标siRNA本身。

3. 非靶向siRNA阴性对照

用于建立背景基线，并帮助区分目标siRNA产生的特异性效应与核酸递送产生的非特异性影响。

4. 阳性siRNA对照

使用已经验证能够产生稳定敲低效果的siRNA，有助于判断当前转染体系本身是否正常。

例如，如果阳性对照同样完全敲不下来，那么首先应该怀疑转染条件、细胞状态或者检测体系，而不是立即认定新的目标siRNA设计失败。

5. 目标siRNA实验组

最终用于判断研究目标基因的特异性沉默效果。

七、不同实验结果组合分别说明什么问题？

如果实验已经明确出现“siRNA进不去”“mRNA敲不下来”或者“同样条件重复性很差”，则属于故障排查问题，可以继续查看siRNA电转染效率低怎么办？从递送到基因沉默排查。

八、判断siRNA转染效果，不要只比较一个时间点

siRNA产生的RNAi效果具有时间过程。

mRNA下降和蛋白下降不一定同时达到最明显状态。

第一次建立某个目标基因的siRNA实验时，可以根据已有文献和目标分子的生物学特点，设置合理的时间梯度。

例如重点观察：

• 递送以后细胞什么时候恢复稳定；

• 目标mRNA什么时候开始明显下降；

• 目标蛋白什么时候出现变化；

• 敲低效果可以维持多久；

• 细胞功能或表型什么时候最明显。

通过这种方式得到的结果，比统一规定“所有siRNA实验都在48小时检测”更加可靠。

九、电转siRNA时，应该怎样评价一个脉冲条件是否值得保留？

如果使用的是电穿孔递送siRNA，可以把每一组电转条件理解成一个需要综合评分的实验组。

建议每组至少记录：

• 电转杯规格；

• 细胞数量及转染前活率；

• siRNA加入量；

• 电压或电场强度；

• 脉冲宽度；

• 脉冲次数；

• 多脉冲间隔；

• 电转后活率；

• mRNA敲低程度；

• 蛋白或功能结果。

假设A组mRNA敲低90%，但细胞活率只有30%；B组敲低75%，但细胞活率达到85%，对于很多需要继续培养和功能分析的实验，B组反而可能更有实际价值。

所以电穿孔参数优化最终寻找的不是“敲低率最高点”，而是敲低效果、细胞活率和实验重复性之间更合适的工作窗口。

十、长期做siRNA电转，设备应该帮助记录什么？

当实验进入参数优化阶段以后，如果设备只能显示一个设定电压，而无法清楚记录实际脉冲过程，后续很难判断两次实验是否真正使用了相同条件。

对于悬浮细胞、原代细胞及其他真核细胞siRNA电转，更值得关注：

• 脉冲强度和脉冲时间能否独立调整；

• 是否支持多脉冲及脉冲间隔设置；

• 能否查看实际脉冲波形；

• 能否记录实验程序；

• 能否检查样品电阻或异常放电状态。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪主要面向哺乳动物细胞、悬浮细胞、原代细胞及干细胞等真核细胞转染，可独立设置方波脉冲强度、时间、次数及间隔，并支持实际波形显示和预脉冲电阻测量。

图4：Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于真核细胞电转条件筛选，并记录脉冲输出及实验参数。

根据当前产品参数，Gene Pulser 830支持1–99个脉冲组合、0.001–10 s脉冲间隔、实际电压及波形显示，并可保存实验方案和历史记录，适合需要反复进行参数比较的细胞电转实验。

十一、一个完整的siRNA结果应该怎样汇报？

如果希望实验结果真正具有可解释性，最终报告不建议只写一句“siRNA转染效率为80%”。

更加清楚的表达可以是：

在当前细胞及转染条件下，siRNA递送阳性细胞比例为多少，目标mRNA相对阴性对照下降多少，目标蛋白是否同步下降，转染后细胞活率是多少，并说明检测时间。

这样别人能够清楚知道这个“效率”究竟指的是哪个环节，也更加方便后续重复和比较实验。

总结：siRNA转染成功要同时回答四个问题

评价siRNA实验结果，可以最终归纳为四个问题：

第一，siRNA有没有成功递送进入细胞？

第二，目标mRNA有没有出现预期下降？

第三，目标蛋白或功能表型有没有发生相应变化？

第四，在获得敲低结果的同时，细胞状态是否仍然满足后续实验要求？

只有把递送、mRNA、蛋白和细胞活率分开评价，才能避免把“荧光阳性”错误理解成“基因沉默成功”。

如果目前还处于悬浮细胞siRNA实验流程建立阶段，可查看悬浮细胞siRNA转染步骤；如果还没有确定使用脂质体还是电穿孔，可以查看siRNA电转染和脂质体转染怎么选；如果已经完成实验但敲低效果不理想，则进一步查看siRNA电转染效率低怎么办？从递送到基因沉默排查。