mRNA转染广泛用于瞬时蛋白表达、基因功能研究、免疫细胞工程以及部分细胞治疗相关研究。与质粒DNA相比，mRNA进入细胞质后可以直接进入翻译过程，不需要先进入细胞核，因此在T细胞、NK细胞、树突状细胞以及其他原代细胞中具有重要应用价值。

不过，mRNA电转染并不是“把RNA加入电转杯，再选择一个电压”这么简单。最终能够检测到多少目的蛋白，不仅取决于mRNA有没有进入细胞，还受到mRNA完整性、5′帽结构、poly(A)尾、RNA杂质、细胞状态、电转缓冲体系、脉冲条件以及电转后恢复等多个环节影响。

因此，评价mRNA电转实验时，最好把递送效率、细胞活率和最终蛋白表达分开来看，而不是只用一个“转染率”概括全部结果。

一、为什么mRNA电转染和质粒DNA电转染不完全一样？

mRNA和质粒DNA虽然都属于核酸，但进入细胞后的生物学路径并不相同。

质粒DNA通常需要进一步进入细胞核，才能进行转录并最终产生蛋白。而mRNA进入细胞质后，可以直接被核糖体识别并参与蛋白翻译。

这意味着，在一些不容易完成核内DNA递送的原代细胞和免疫细胞中，mRNA可以成为更加直接的瞬时表达方案。

同时，mRNA通常不会作为稳定转基因长期存在，因此表达具有明显的暂时性。对于只需要短期表达CAR、TCR、报告蛋白、转录因子或其他功能蛋白的实验，这种特征反而可能具有优势。

二、mRNA质量为什么是电转染首先要排查的因素？

电脉冲只能帮助mRNA进入细胞，并不能修复已经降解或者质量不合格的RNA。

因此，如果同一套电转参数过去能够获得较好结果，近期却突然出现蛋白表达下降，除了检查细胞和设备条件以外，还应该首先确认mRNA本身是否发生变化。

对于体外转录mRNA，值得关注的质量因素包括：

• RNA是否保持完整；

• 目的序列是否正确；

• 5′端帽结构是否完整；

• poly(A)尾是否符合实验设计；

• 是否存在明显截短RNA；

• 是否残留模板DNA、酶或其他反应成分；

• 是否存在较多双链RNA等副产物；

• RNA保存和冻融过程中是否发生降解。

这些因素不仅可能影响最终翻译效率，也可能改变细胞对于外源RNA的应答。

三、为什么只测A260/A280不能证明mRNA质量合格？

原来的文章把“A260/A280达到某个范围”直接作为高质量RNA的重要判断标准，这种方法过于简单。

紫外吸光比值可以帮助判断核酸样品是否存在部分蛋白或其他污染，但它无法回答很多与mRNA功能直接相关的问题。

例如，仅凭A260/A280不能判断：

• mRNA是否已经部分断裂；

• 5′帽结构效率如何；

• poly(A)尾长度和完整性如何；

• 是否含有大量双链RNA；

• 是否存在截短转录产物；

• mRNA进入细胞以后是否具有良好翻译能力。

因此，A260/A280可以作为核酸基础质量检查的一部分，但不能单独等同于“mRNA转染质量合格”。

四、5′帽和poly(A)尾为什么会影响mRNA表达？

成熟真核mRNA的5′帽结构和3′端poly(A)尾对于RNA稳定性和翻译都具有重要意义。

5′帽参与保护mRNA免受降解，并参与翻译起始过程；poly(A)尾同样与mRNA稳定性和翻译效率密切相关。

所以，对于体外转录mRNA来说，即使相同质量的RNA成功进入了细胞，如果不同批次之间的帽结构、poly(A)尾或者完整性不同，最终蛋白表达量仍然可能存在明显差异。

这也是为什么mRNA电转实验中不能只记录“加入了多少微克RNA”，还应该记录RNA批次和制备方法。

五、双链RNA等杂质为什么需要关注？

体外转录过程中除了目标单链mRNA，还可能产生不同类型的副产物，例如截短RNA、异常延伸产物以及不同程度的双链RNA。

部分RNA杂质可能激活细胞的先天免疫识别通路，从而影响细胞状态、蛋白表达和实验重复性。

这一问题在树突状细胞、T细胞、PBMC以及其他免疫相关细胞中尤其值得关注，因为这些细胞本身就具备较强的核酸感知能力。

因此，如果出现：

• mRNA明明已经进入细胞，但表达量很低；

• 细胞状态突然变差；

• 不同mRNA批次表现差异明显；

• 出现明显的细胞应激反应

除了调整电脉冲，还应该重新检查mRNA制备和纯化质量。

六、RNA操作为什么必须重视RNase污染和反复冻融？

RNA比DNA更容易受到RNase影响，而RNase又广泛存在于实验环境中。

因此，mRNA电转前的操作过程同样可能影响最终实验。

建议尽量做到：

• 使用无RNase耗材；

• 减少样品长时间暴露；

• 按照RNA实际保存要求进行分装；

• 避免没有必要的反复冻融；

• 保持不同实验批次操作流程一致。

如果电转设备参数完全没有变化，但近期结果逐渐下降，RNA保存历史也是应该检查的变量之一。

七、细胞状态为什么会直接改变mRNA电转结果？

mRNA质量相同、设备设置相同，也不意味着不同批次细胞一定能够获得相同结果。

细胞状态本身就是mRNA电转的重要变量。

需要重点关注：

• 具体细胞类型；

• 细胞电转前活率；

• 细胞培养和增殖状态；

• 传代历史；

• 免疫细胞是否经过激活；

• 原代细胞供体或批次差异；

• 细胞收集和重悬过程是否造成额外损伤。

原文章使用“所有细胞转染前都应达到70%～80%密度”的表达并不准确。

这种汇合度概念主要适用于部分贴壁细胞培养场景，而T细胞、NK细胞、PBMC等悬浮细胞根本不使用70%～80%汇合度作为主要判断指标。

所以mRNA电转应该根据具体细胞体系判断状态，而不是套用一个统一的细胞密度百分比。

八、电场强度、脉宽和脉冲次数为什么必须一起看？

mRNA电转的另一个核心环节是电脉冲。

电压只是其中一个变量。

完整电转条件通常还需要同时考虑：

• 电转杯电极间距；

• 电压或电场强度；

• 脉冲波形；

• 单次脉冲持续时间；

• 脉冲次数；

• 多个脉冲之间的间隔；

• 样品总体积；

• 缓冲体系和电导状态。

例如，即使电压完全相同，1 mm和2 mm电极间距对应的实际电场条件也不同。

同样，保持电压不变而增加脉宽或脉冲次数，也会改变细胞受到的电刺激程度。

如果需要进一步理解为什么论文参数不能只复制电压，可以查看复制电穿孔参数为什么失败？。

九、为什么不能直接寻找一套“mRNA通用电转参数”？

mRNA本身虽然不需要进入细胞核就能够进行翻译，但这并不意味着所有细胞都可以使用同一组电脉冲。

不同细胞在大小、膜结构、电刺激耐受能力和恢复能力方面都可能存在明显差异。

例如：

• T细胞和NK细胞对于脉冲损伤比较敏感；

• 不同激活状态的T细胞可能需要不同条件；

• 肿瘤细胞系和原代细胞的耐受窗口可能不同；

• 不同供体来源PBMC之间也可能存在明显差异。

因此，某篇论文中的mRNA电转条件只能作为与其细胞体系接近时的实验起点，而不能直接当成通用程序。

对于原代细胞和免疫细胞，可以进一步查看原代细胞、免疫细胞电转参数为什么不能照搬普通细胞系？。

十、电转缓冲液为什么不仅仅是“装细胞的液体”？

电转过程中，缓冲体系会直接影响样品的电导率、渗透状态以及电脉冲时的电流变化。

如果缓冲液组成发生明显变化，即使细胞、mRNA和设备设置完全相同，实际放电状态也可能改变。

需要注意的变量包括：

• 缓冲液组成；

• 盐离子浓度；

• pH和渗透压；

• mRNA溶液带入的盐和其他组分；

• 最终样品体积。

如果样品电导过高，还可能增加异常放电风险。

所以，电转条件优化应该把缓冲液视为实验参数的一部分，而不是只记录设备电压。

十一、mRNA加入量是不是越高越好？

不是。

增加mRNA用量可能在一定范围内增加可供翻译的模板，但超过合适范围以后，蛋白表达不一定继续线性增加。

同时，过高的RNA负荷可能改变样品电导状态，也可能增加细胞应激。

因此，原文章给出统一的“1～10 μg/mL”推荐范围并不合适。

真正需要优化的是当前细胞数量、反应总体积、mRNA种类、目标表达水平和细胞耐受性之间的关系。

如果实验目的是比较RNA剂量，应该尽量保持细胞数量、电转杯、缓冲液和电脉冲条件不变，只改变mRNA加入量，这样才能判断剂量本身的影响。

十二、mRNA电转为什么一定要同时测效率和活率？

电穿孔实验最容易出现的误区，是只追求最高的阳性率。

当电脉冲增强时，mRNA递送可能增加，但细胞损伤也可能同步增加。

例如两个条件：

• A条件：95%阳性，但最终只有少量细胞存活；

• B条件：85%阳性，但大部分细胞状态良好并可以继续扩增。

如果后续还需要进行培养、功能检测或者细胞治疗相关研究，B条件可能反而更有价值。

因此，更完整的评价应该同时记录：

• mRNA递送或目的蛋白阳性率；

• 电转后细胞活率；

• 实际存活细胞总数；

• 阳性活细胞数量；

• 细胞恢复和增殖状态；

• 最终需要的功能指标。

如果当前主要问题是电转后死亡严重，可以查看电转后细胞死亡严重怎么办？7步排查活率低原因。

如果细胞活率尚可但始终难以获得理想阳性率，可以进一步查看电穿孔转染效率低怎么办？先排查这6个关键变量。

十三、mRNA电转以后应该什么时候检测？

原来的文章直接规定“qPCR 48小时、蛋白72小时”，对于mRNA电转来说并不合适。

因为mRNA进入细胞质后可以较快进入翻译过程，一些研究中能够在较短时间内观察到蛋白表达。

但最终的表达峰值和持续时间会受到以下因素影响：

• mRNA稳定性；

• 5′帽和poly(A)尾设计；

• 目标蛋白本身的半衰期；

• 细胞类型；

• 递送的mRNA剂量；

• 实验最终检测指标。

所以检测时间应该根据目的基因、细胞和实验终点设计，而不是统一规定成48小时或72小时。

十四、mRNA电转和脂质体转染应该怎么选？

mRNA并不只能通过电穿孔递送。

对于部分容易转染的贴壁细胞，脂质体或其他化学转染试剂可能操作简单，而且不需要电转设备。

电穿孔则在部分原代细胞、免疫细胞和难转染细胞中具有明显应用价值，因为它不依赖细胞通过内吞作用摄取转染复合物，而是利用短时间电脉冲直接改变膜通透性。

两种方法没有绝对的“谁一定更好”。

最终选择应该根据细胞类型、样本量、实验目的和效率/活率要求决定。

十五、为什么“无血清环境更适合RNA转染”不能一概而论？

是否需要无血清条件，与转染方法和具体试剂有关。

某些化学转染试剂在形成RNA-试剂复合物时具有特定的培养基要求，但也有试剂能够兼容血清。

对于电穿孔而言，电脉冲阶段通常使用专门的电转缓冲体系，而不是简单把细胞放到普通“无血清培养基”里完成电转。

电转完成以后，又通常需要尽快把细胞恢复到适合其生长的培养环境中。

因此，不应该把“无血清更适合RNA转染”写成适用于所有RNA和所有转染方法的通用规则。

十六、怎样判断mRNA电转失败究竟是哪一步出了问题？

可以把mRNA电转实验拆成三个层级进行排查。

第一层：RNA有没有正常进入细胞？

如果递送本身就很低，重点检查细胞状态、电转参数、电转杯、缓冲液以及mRNA加入量。

第二层：RNA进入以后有没有正常表达？

如果递送证据正常，但蛋白表达明显偏低，应进一步检查mRNA完整性、帽结构、poly(A)尾、序列设计和RNA杂质。

第三层：细胞有没有正常恢复？

如果阳性率很高但细胞大量死亡，则应该降低总体电刺激或者检查缓冲体系、操作损伤和恢复培养条件。

这种方式比单纯看到“表达低”以后就继续升高电压更容易找到真正原因。

十七、mRNA电转设备选型应该重点看什么？

如果实验室长期进行哺乳动物细胞、原代细胞、T细胞、NK细胞、PBMC以及其他真核细胞的mRNA电转，设备选型重点应该放在脉冲控制能力和实验重复性上。

值得重点关注：

• 是否支持适合真核细胞的方波脉冲；

• 脉冲时间是否能够独立设置；

• 是否支持多个脉冲；

• 脉冲间隔是否可调；

• 实际输出波形是否能够查看；

• 是否能够检测电转前样品状态；

• 实验方案是否方便保存和重复调用。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪支持对方波脉冲时间、脉冲次数和脉冲间隔进行组合设置，并可显示实际脉冲波形，适用于哺乳动物细胞、原代细胞、干细胞及其他真核细胞的核酸递送研究。

目前产品实测资料中还包括HepG2细胞GFP mRNA电转案例，在特定细胞批次、2 mm电转杯及对应实验条件下获得了较高的阳性率和细胞活率。

需要强调的是，这类实测数据只能证明设备在对应细胞、mRNA、缓冲体系和脉冲条件下获得过相应结果，不能把该组参数直接作为T细胞、NK细胞、PBMC或者其他细胞的通用mRNA程序。

如果还不确定自己的实验应该采用细胞电转染还是微生物电转化，可以查看电转染和电转化怎么选？从样品类型到电穿孔仪选型指南。

十八、建立mRNA电转条件时建议怎么优化？

对于一个新的细胞-mRNA组合，建议先确定一个接近当前实验对象的可靠文献或历史条件作为起点，再采用受控变量方式逐步优化。

可以按以下顺序进行：

1. 先确认mRNA质量和完整性；

2. 固定细胞批次、电转杯和缓冲体系；

3. 选择一个合理脉冲起点；

4. 小范围比较电脉冲条件；

5. 同时记录目的蛋白阳性率和细胞活率；

6. 找到大致有效区域后再优化mRNA加入量；

7. 最后根据实验目的确定最佳检测时间。

如果一次同时改变RNA量、电压、脉宽、脉冲次数、缓冲液和细胞密度，即使结果变好，也很难知道真正起作用的是哪个变量。

总结：mRNA电转优化不能只盯着电压

mRNA电转染最终表现出来的蛋白表达，是RNA质量、细胞状态、电脉冲和电转后恢复共同作用的结果。

mRNA本身需要关注完整性、5′帽、poly(A)尾以及杂质；细胞需要关注活率、培养状态和批次；电脉冲则需要同时考虑电压、电转杯间距、脉宽、次数和间隔。

因此，实验结果不理想时，不应该简单地继续升高电压，也不能根据A260/A280正常就认定RNA没有问题。

更有效的做法是把“RNA有没有进去”“进去以后有没有表达”“细胞能不能恢复”三个问题分开排查，再通过受控变量逐步找到适合当前细胞和mRNA的效率/活率平衡。

如果实验室长期进行mRNA、质粒DNA、siRNA或其他核酸的真核细胞电转，可以进一步查看Gene Pulser 830方波电穿孔仪以及电穿孔仪产品系列， 根据细胞类型、递送物和脉冲控制需求选择相应平台。

参考资料

1. Van Driessche A, Ponsaerts P, Van Bockstaele DR, et al. The Ins and Outs of Messenger RNA Electroporation for Physical Gene Delivery in Immune Cell-Based Therapy. Pharmaceutics. 2021.

2. Gerer KF, Hoyer S, Dörrie J, Schaft N. Electroporation of mRNA as a Universal Technology Platform to Transfect a Variety of Primary Cells with Antigens and Functional Proteins. Methods Mol Biol. 2017.

3. Recent reviews on in vitro-transcribed mRNA preparation and purification have emphasized RNA integrity, 5′ capping, poly(A) characteristics and removal of dsRNA or truncated byproducts as important mRNA quality attributes.